Importancia del Nitrógeno para las Levaduras

Las levaduras que transforman el jugo de uva en vino requieren de nutrientes, además de los azúcares, para que la fermentación se lleve a cabo.  Los nutrientes utilizados por las levaduras pueden ser divididos en macro-nutrientes y micro-nutrientes.  Sin una cantidad mínima de estos nutrientes, las levaduras no pueden llevar a cabo proceso fisiológicos básicos como la síntesis de proteínas estructurales, generación de lípidos para la membrana celular, etc.  Sin estos nutrientes las levaduras tampoco podrán llevar a cabo procesos metabólicos básicos como división celular, respiración, etc.  Los macro-nutrientes básicos para las levaduras son la glucosa y la fructosa.  Por otro lado, los micro-nutrientes que más comúnmente son requeridos por las levaduras son nitrógeno, fósforo, potasio, cinc, magnesio, etc. 

Durante una fermentación, la glucosa y fructosa no son limitantes, de hecho, se encuentran en concentraciones muy superiores a las requeridas para la sobrevivencia de las levaduras.  Debido a la gran cantidad de azúcares en un mosto, la concentración de levaduras se incrementa de unos cuantos cientos de células por mililitro al inicio de la fermentación, hasta aproximadamente 100-200 millones cel/mL antes de terminar la fermentación.  Para que se pueda incrementar la concentración de células por mililitro, es necesario que además de los macro-nutrientes (azúcares), se tenga en el mosto una serie de micro-nutrientes que le servirán a las nuevas células a generar nueva pared celular así como para llevar a cabo procesos metabólicos que mantengan vivos a estos micro-organismos. 

                Cuando la concentración de micronutrientes en los mostos no es adecuado, las células de levadura no pueden dividirse adecuadamente y no pueden llevar a cabo procesos metabólicos básicos como la respiración, crecimiento, y la fermentación, entre otras.  La falta de los nutrientes necesarios para llevar a cabo los procesos metabólicos puede conllevar a que las fermentaciones sean muy lentas o que no terminen, es decir, que no se consuman todos los azúcares.  A la las fermentaciones que no terminan de consumir todos los azúcares son llamadas fermentaciones atoradas.  Las fermentaciones lentas y/o fermentaciones atorados suelen ser muy problemáticas debido a que se incrementan las concentraciones de otros micro-organismos en los mostos que potencialmente pueden generar sabores o aromas no aceptables en un vino de calidad.  El crecimiento de otras levaduras no-Saccharomyces (Pichia, Klokera, etc.) y bacterias también reduce la concentración de nutrientes en el mosto, lo cual resulta aun más problemático para el crecimiento de las levaduras (Saccharomyces).  

                 Se ha demostrado que el nitrógeno es uno de las micronutrientes más importantes para mantener el metabolismo de las levaduras.   El nitrógeno es un elemento fundamental para la síntesis de aminoácidos, proteínas, y otros metabolitos fundamentales en la fisiología de las levaduras.  El nitrógeno en el mosto proviene principalmente de las uvas y de la lisis de microorganismos del mosto.  La concentración del nitrógeno en las uvas fluctúa a lo largo del tiempo de maduración de las uvas, es dependiente del varietal, es influenciado por los tipos y tiempos de fertilización.  En general, se ha demostrado que la concentración de nitrógeno en las uvas se reduce a medida que la uva madura.  Bajo los esquemas actuales de sobre-maduración de las uvas con la idea de generar vinos corpulentos, las uvas tienden a ser cosechadas con niveles bajos de nitrógeno.  En algunos casos, los niveles de nitrógeno son tan bajos que no pueden soportar el crecimiento y el metabolismo de las levaduras.  Lo anterior conlleva a que las fermentaciones sean lentas o se atoren.  Para evitar esto, los productores de vino pueden estimar la concentración de nitrógeno (y otros nutrientes) en los mostos antes de iniciar la fermentación, y en caso de ser necesario se pueden añadir nutrientes para que el crecimiento de las levaduras no se vea limitado.

                En el caso de levaduras Saccharomyces, existen cepas que requieren altos  niveles de nitrógeno para llevar a cabo fermentaciones totales, mientras que otras cepas requieren niveles bajos de nitrógeno para completar la fermentación.  Por ejemplo, en la siguiente figura se presentan los niveles mínimos que requieren algunas cepas de levaduras para completar una fermentación.  Se puede ver claramente que la cepa Maurivin B requiere cuando menos 300 mg/L de nitrógeno asimilable mientras que la cepa AWRI R2 requiere al menos 400 mg/L de nitrógeno asimilable para completar la fermentación. 

En Baja California, y en México no se ha reportado la variación de la concentración de nitrógeno en el mosto a lo largo de la maduración de las uvas.  Tampoco se han reportado las variaciones en la concentración de nitrógeno en los mostos de los diferentes varietales producidos en Baja California.  Se desconoce también el efecto del nitrógeno asimilable sobre la fermentación en mostos de Baja California. 

Las levaduras utilizan nitrógeno en forma de amonio y aminoácidos durante la fermentación.  Estas formas de nitrógeno orgánico son conocidas como nitrógeno asimilable por las levadura (NAL, o YAN por sus siglas en inglés).  El NAL es requerido para la síntesis de proteínas estructurales, enzimas y pared celular.  Por lo anterior, niveles bajos de NAL en el mosto pueden resultar en fermentaciones lentas o atoradas, además de la producción de niveles altos de sulfuro de hidrógeno (H₂S).  Para evitar estos problemas, fosfato di-amónico (DAP) es añadido al mosto antes y durante la fermentación.  Las diferentes cepas de levadura requieren diferentes cantidades de NAL, por lo que la cantidad de DAP añadido varía dependiendo de la cepa utilizada durante la fermentación.  Estudios demuestran que las levaduras requieren cuando menos 350 mg N/L para completar la fermentación, sin embargo, algunos autores aseguran que solo se requieren 150-200 mg N/L.

                Realizamos algunos experimentos para evaluar el efecto de la concentración de nitrógeno sobre la fermentación.  En la siguiente figura se puede observar que las fermentaciones en mostos con niveles bajo de nitrógeno (100-150 mg N/L) son mucho más lentas que las que tienen altos niveles de nitrógeno (250-500 mg N/L).  Las fermentaciones con bajos niveles de nitrógeno tardaron 20 días para consumir todos los azúcares, mientras que las fermentaciones con altos niveles de nitrógeno tardaron 10 días en consumir todos los azúcares.  Es claro que el añadir nitrógeno a los mostos puede ayudar a que las fermentaciones sean más saludables, más rápidas y que los vinos terminen con mejores características organolépticas. 

                En la siguiente figura se puede observar que independientemente de la concentración de nitrógeno en el mosto, el consumo de este nutriente es muy rápido.  Es decir, las fermentaciones con 100 o con 500 mg N/L consumieron todo el nitrógeno en 5-8 días.  Lo anterior se debe a que las levaduras mantienen una tasa de división muy rápida en los primeros días de la fermentación y es cuando requieren las mayores cantidades de nitrógeno para generar proteínas, pared celular, ácidos nucléicos, etc. 

                El crecimiento de las células de levadura se puede observar en la siguiente figura.  Es claro que el crecimiento de las células es mucho más rápido mientras haya nitrógeno en el mosto (en los primeros 4-5 días de la fermentación).  Después de reducirse los niveles de nitrógeno, el crecimiento del número de células de levadura para y de hecho empieza a haber una mortalidad de células.  Por otro lado, el número de células en los mostos con bajas cantidades de nitrógeno es mucho menor (60 millones de células/mL) que la cantidad de células en los mostos que tienen altos niveles de nitrógeno (120 millones de células/mL).  Se ha demostrado que se requieren cuando menos 100 millones de células/mL en un mosto para que se lleve a cabo una buena fermentación.  Lo anterior sugiere que es crítico conocer la concentración de nitrógeno en los mostos y si es necesario añadir nitrógeno y otros nutrientes para llevar a cabo una fermentación exitosa.